Para peneliti dari EMBL Hamburg, bersama dengan para ilmuwan dari Leibniz Research Institute for Molecular Pharmacology (FMP), telah menghasilkan peta yang sangat rinci tentang bagaimana influenza A merombak sel manusia yang terinfeksi. Alur kerja khusus mereka memungkinkan mereka mengamati interaksi protein langsung di dalam sel utuh daripada hanya mengandalkan sampel yang rusak.
Influenza musiman menyebabkan antara 3 dan 5 juta kasus penyakit serius di seluruh dunia setiap tahunnya dan menyebabkan 650.000 kematian. Influenza A juga telah menyebabkan beberapa pandemi, termasuk pandemi flu Spanyol tahun 1918.
Setelah memasuki sel, virus melepaskan RNA yang berisi instruksi untuk membuat sejumlah kecil protein virus. Protein ini menyebar ke seluruh sel inang dan mengarahkan sistem molekulernya, sehingga mengubah sel menjadi tempat produksi partikel virus baru.
Memetakan virus influenza di dalam sel utuh
Pandangan yang lebih jelas mengenai pengambilalihan ini dapat membantu para ilmuwan mengembangkan vaksin flu dan obat antivirus yang lebih efektif. Untuk mencapai tujuan ini, para peneliti perlu mengetahui protein virus mana yang berinteraksi dengan protein manusia, di mana kontak tersebut terjadi, dan bagaimana virus menggunakannya untuk mendukung replikasinya sendiri.
Studi baru ini adalah yang pertama memetakan kontak langsung antara protein influenza dan protein manusia dalam skala besar di dalam sel utuh yang terinfeksi. Detail strukturalnya juga cukup tepat sehingga para peneliti dapat memodelkan bagaimana protein yang berinteraksi dapat menyatu.
“Pekerjaan kami menawarkan cara baru untuk mempelajari interaksi inang influenza dalam konteks aslinya dan dengan wawasan struktural,” kata Jan Kosinski, ketua kelompok di EMBL Hamburg dan Pusat Biologi Sistem Struktural (CSSB). “Hasil saat ini adalah gambaran singkat dari satu titik waktu selama infeksi dan membuka pintu untuk mempelajari interaksi inang influenza sepanjang siklus infeksi.”
Mengatasi masalah eksperimental yang besar
Memantau interaksi protein-protein selama infeksi aktif sangatlah sulit. Banyak penelitian sebelumnya mengandalkan teknik biokimia yang mengharuskan ilmuwan membuka sel sebelum mengukur kontak antar protein.
Proses ini dapat mendistorsi apa yang terjadi di dalam sel hidup. Setelah kompartemen internal dihancurkan, protein yang awalnya terpisah dapat bersentuhan di laboratorium. Pada saat yang sama, interaksi yang lemah, bersifat sementara, atau spesifik lokasi mungkin hilang. Akibatnya, peneliti mungkin kesulitan menentukan hubungan mana yang sebenarnya ada selama infeksi.
“Saat itulah kami mengetahui bahwa kolaborator kami, Boris Bogdanow dan Fan Liu, di FMP Berlin, telah mengembangkan versi khusus spektrometri massa ikatan silang (XL-MS), sebuah teknik lama untuk memetakan kontak protein, yang dirancang khusus untuk sel yang terinfeksi virus,” kata Kosinski.
Metode khusus memberikan terobosan yang dibutuhkan tim. Hal ini memungkinkan untuk menangkap interaksi yang hanya terjadi sebentar atau di wilayah tertentu dari sel yang terinfeksi.
“XL-MS memungkinkan kita menangkap interaksi protein-protein secara langsung dalam sel utuh yang terinfeksi, sekaligus memberikan informasi struktural tentang bagaimana interaksi ini terjadi,” jelas Bogdanow, yang kini menjadi kepala kelompok penelitian junior di Institut Virologi di Charité – Universitätsmedizin Berlin. “Hal ini memberi kita wawasan tentang hubungan antara virus dan sel manusia dan, melalui pemodelan struktural, dapat membantu mengidentifikasi target yang dapat ditindaklanjuti untuk intervensi farmasi di masa depan.”
Gabungkan data eksperimen dengan AlphaFold
Para peneliti menggabungkan hasil XL-MS mereka dengan pemodelan struktural komputasi. Hal ini memungkinkan mereka untuk mengidentifikasi interaksi protein virus dan manusia dan memperkirakan bagaimana posisi protein-protein ini ketika mereka terhubung.
Untuk membangun model struktural ini, tim menggunakan versi modifikasi dari AlphaFold, algoritma prediksi struktur protein pemenang Hadiah Nobel.
“Keuntungan utama dari pendekatan AlphaFold yang dimodifikasi adalah memungkinkan kami untuk memperkenalkan data cross-linking eksperimental kami langsung ke dalam pemodelan struktural,” jelas Kosinski. “Hal ini memberi tahu model bagian mana dari virus dan protein inang yang berdekatan satu sama lain di dalam sel yang terinfeksi. Hal ini terbukti sangat berguna untuk kompleks inang virus, yang seringkali sulit diprediksi secara andal.”
Dua cara flu membajak sel manusia
Hasilnya, dipublikasikan di Mikrobiologi alamimengungkapkan dua strategi penting yang tampaknya digunakan influenza A untuk mengambil alih sel.
Yang pertama berfokus pada hemagglutinin, protein yang ada di permukaan virus. Influenza menggunakan hemaglutinin untuk menempel dan memasuki sel inang. Para peneliti melacak protein ini saat bergerak melalui transportasi internal sel dan jaringan pemrosesan.
Jaringan ini terdiri dari kompartemen yang melipat, memodifikasi, dan menyiapkan protein sebelum mengirimnya ke lokasi akhirnya. Analisis menunjukkan bahwa beberapa protein manusia membantu melipat dan memodifikasi hemaglutinin dengan baik selama infeksi. Beberapa dari protein inang ini sebelumnya memiliki fungsi yang kurang dipahami.
Flu melarutkan struktur inti
Penemuan kedua melibatkan parapeckles, kompartemen kecil seperti tetesan yang terletak di dalam inti sel. Tim menemukan bahwa infeksi influenza A menyebabkan struktur ini hancur.
Ketika paraspeckles pecah, mereka melepaskan protein pengikat RNA yang terkandung di dalamnya. Virus kemudian dapat menggunakan protein ini untuk mendukung replikasinya sendiri.
“Yang paling mengejutkan kami adalah paraspeckles,” kata Iuliia Kotova, mantan rekan predoktoral grup Kosinski di EMBL Hamburg, sekarang di ETH Zurich dan penulis pertama publikasi tersebut. “Mengamati organel inti kecil ini larut secara konsisten di setiap lini sel dan strain flu yang kami uji, memberi tahu kami bahwa ini bukanlah efek samping dari infeksi, melainkan sebuah strategi.”
Gangguan ini dapat memberikan lebih dari satu keuntungan bagi flu.
“Mungkin juga ada manfaat kedua dari virus ini: beberapa bukti menunjukkan bahwa paraspeckles berkontribusi terhadap respons stres seluler dan regulasi gen antivirus, sehingga mengganggu mereka juga dapat melemahkan bagian dari respons pertahanan sel,” tambah Kosinski.
Sebuah upaya kolaboratif antara tiga institusi
Proyek ini bergantung pada pertukaran teknologi dan keahlian dari tiga institusi. Para peneliti melakukan pekerjaan spektrometri massa ikatan silang di Charité di Berlin. Analisis glikoproteomik dilakukan di pusat proteomik EMBL.
Tim melakukan pemodelan AlphaFold pada cluster komputasi EMBL, sementara pencitraan mikroskopis dilakukan di fasilitas Advanced Light and Fluorescence Microscopy (ALFM) CSSB.
Cara baru untuk mempelajari potensi virus pandemi
Hasilnya menunjukkan bagaimana mempelajari kontak molekuler di dalam sel utuh yang terinfeksi dapat mengungkap di mana dan bagaimana virus mengendalikan mesin seluler manusia. Para peneliti mengatakan “pemetaan konteks” semacam ini juga dapat membantu menjelaskan cara kerja virus lain.
“Meskipun faktor dan mekanisme inang yang tepat sering kali berbeda antar virus, kami yakin pendekatan kami secara keseluruhan – yang menggabungkan hubungan silang seluler, pemodelan struktural, dan pemantauan biologi sel yang ditargetkan untuk memetakan interaksi inang virus asli pada tahap infeksi tertentu – masih dapat diterapkan secara luas,” kata Kosinski.
Meskipun penelitian tersebut mengamati jenis flu yang diadaptasi di laboratorium, para peneliti yakin strategi yang sama pada akhirnya dapat digunakan untuk mempelajari virus dengan potensi pandemi yang lebih besar.
Bogdanow setuju: “Meskipun penelitian ini berfokus pada strain yang diadaptasi di laboratorium, penelitian ini meletakkan dasar untuk menerapkan metodologi terhadap virus yang berpotensi menjadi pandemi, seperti H5N1, dan untuk mengungkap jaringan interaksi yang mendukung penggandaan virus tersebut dalam sel manusia.
